ЗВІТ ПО ДОСЛІДЖЕННЮ
«Контроль якості біопрепарату «Лактокен Фемін»: визначення кількісного і якісного складу»
Для дослідження якості біопрепарату, а саме дієтичної добавки “Лактокен Фемін”, наданої замовником ТОВ “ЕС ФАРМА” у вигляді капсул, с. п. EF2101015, виробництва Біоділ Фармасьютікалс Пвт. Лтд, Індія, нами проведено мікробіологічний аналіз кількісного вмісту всіх ізольованих мікроорганізмів та здійснено їх біохімічну ідентифікацію.
Замовником, надано 2 упаковки препарату. Форма препарату це темно-рожевого кольору капсула, наповнена гранульованим порошком білого кольору з характерним запахом, що відповідає заявленим характеристикам.
У відповідності до заявленого на упаковці складу препарату (лакто- і біфідобактерій), а також враховуючи унікальні культуральні особливості останніх, для їх виділення використовували адекватні селективні поживні середовища, застосовували видоспецифічні температури вирощування, аеробні та анаеробні умови тощо.
Всі дослідження виконували згідно внутрішнього протоколу, затверджено директором із наукового розвитку ТОВ «Едієнс» д. б. н., проф. Бойко Надією Володимирівною.
Вміст біопрепарату “Лактокен Фемін” попередньо розчиняли у бульйоні (MRS Broth) для виділення пробіотичних штамів. Визначення вмісту різних штамів мікроорганізмів у складі препарату проводили кількісним методом. Для цього одержану суспензію титрували (методом серійних розведень) і висівали по 10 мкл кожного розведення (10¹ , 10², 10⁴, 10⁶, 10⁸, 10¹º) в двох повторах на відповідні поживні середовища, зокрема:
1) MRS – агар (середовище із додаванням марганцю, магнію та ацетату для вирощування лактобактерій),
2) Bifidobacterium агар (модифікований агар для вирощування біфідобактерій),
3) удосконалений нами “капустяний” агар (середовище для культивування лакто- та біфідобактерій), авторського складу.
Зразки інкубували в аеробних та мікроаерофільних (факультативно-анаеробних умовах, при 5% СО₂) та при двох температурних режимах (37 °С та 42 °С) протягом 48 годин. Анаеробні умови забезпечували шляхом вирощування тестованих культур в анаеростаті малого об’єму з використанням анаеропакетів (поглиначів кисню). Для перевірки даного препарату на наявність умовно-патогенних мікроорганізмів вміст препарату висівали на селективні поживні середовища: кров’яний агар, м'ясо-пептонний агар, агар для вирощування клострирій, Сабуро агар (для виділення мікроскопічних грибів).
Культуральні властивості ізольованих бактерій визначали за характером їхнього росту на щільних поживних середовищах, визначаючи морфотипи одержаних колоній. Для попередньої орієнтовної ідентифікації всіх ізольованих пробіотичних культур досліджували їх морфологічні та тинкторіальні (мікроскопічні) особливості, здійснюючи наступне оцифрування мазка. Остаточну видову ідентифікацію чистих культур мікроорганізмів проводили шляхом використання біохімічних тест-систем ANAEROTEST виробництва Erba LaChema (Брно, Чеська Республіка). Дана система передбачає облік результатів утилізації (розщеплення) 49 вуглеводів та їх похідних: гліцерину, еритриту, D-арабінози, L-арабінози, D-рибози, D-ксилози, L-ксилози, D-адоніту, метил-β-D-ксилопіранозиду, D-галактози, D-глюкози, D-фруктози, D-манози, L-сорбози, L-рамнози, дульциту, інозиту, D-маніту, D-сорбіту, метил-α-D-манопіранозиду, метил-α-D-глюкопіранозиду, N-ацетилглюкопіранозиду, амігдаліну, арбутину, саліцину, D-целобіози, D-мальтози, D-лактози, D-мелібіози, цукрози, D-трегалози, інуліну, D-мелецитози, D-рафінози, крохмалю, глікогену, ксиліту, гентибіози, D-туранози, D-ліксози, D-тагатози, D-фукози, L-фукози, D-арабітолу, L-арабітолу, глюконату, 2-кетоглюконату, 5-кетоглюконату. Заміри результатів реакцій проводили через 48 годин, кодування здійснювали за відповідними таблицями кодів.
Таким чином, нами було охарактеризовано морфологічні, тинкторіальні, культуральні та фізіолого-біохімічні властивості відібраних ізолятів лакто- та біфідобактерій.
За морфологічними ознаками лактобактерії є грампозитивні палички правильної форми з тенденцією до ланцюгоутворення.
За культуральними властивостями вони належать до морфотипів лактобактерій, при цьому демонструючи штамові відмінності в рисунку і пігментах утворених колоній. Так, зокрема на поверхні авторського модифікованого нами капустяного агаризованого середовища було виявлено шість морфовидів різних за формою колоній лактобактерій. Зокрема, до прикладу, один із видів тестованих штамів лактобактерій (ЛАБ) на поверхні капустяного агару та поживного середовища MRS (МРС) утворював дрібні, округлі, білі або білувато-кремові напівпрозорі колонії з цільними краями, тягучої консистенції. Інший штам ЛАБ на поверхні тих же поживних середовищ утворював інший морфотип колоній - дрібні, круглі, блискучі білувато-кремові колонії з білими краями. Третій штам молочнокислих бактерій ріс у вигляді середніх, білих, круглих, випуклих з рівними краями колоній. Також на поверхні поживного середовища MRS (МРС) вирощено напівпрозорі, білуваті колонії, гладенькі з блиском, слабо випуклі, круглі з нерівним краєм, а також опуклі колонії з цілісним краєм, непрозорі і не пігментовані.
Всі ізольовані нами штами ЛАБ за їх біохімічними властивостями були каталазопозитивні і не здатні до відновлення нітратів, що дозволяє віднести їх до роду Lactobacillus. Ізольований штам лактобацил, що зброджував D-манозу, манітол, сорбітол, α-метил-D-глюкозид, лактозу, сахарозу, малазітозу, інулін, β-гентабіозу, D-туранозу, D-ліксозу, D-тагатозу, L-арабітол, глюконат був ідентифікований як Lactobacillus casei. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. casei складав 98,9%.
Встановлено, що ще один штам серед числа ізольованих нами лактобактерій метаболізував L-арабінозу, D-галактозу, D-глюкозу, D- та L-ксилозу, D-лактозу, D-маніт, D-рафінозу, D-сорбіт, D-фруктозу, D-целобіозу, D-цукрозу та не утилізував L-рамнозу. Саме тому він був ідентифікований нами як Lactobacillus рlantarum. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. рlantarum був 99,7 % за цим методом типування.
До виду Lactobacillus acidophilus було віднесено штам ЛАБ, який утилізував N-ацетил-глюкозамін, галактозу, рафінозу. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. acidophilus становив 98,5 %.
Один штам за здатністю метаболізувати L-арабінозу, рибозу, D-манозу, манітол, ά-метил-D-манозид, лактозу, мелібіозу, сахарозу, D-рафінозу, амідон, глікоген, β-гентабіозу, D-туранозу, D-арабітол, глюконат був ідентифікований як Lactobacillus fermentum. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. fermentum складав 98,5 %.
Штам Lactobacillus rhamnosus зброджував целобілозу, галактозу, мальтозу, маніт, манозу, рафінозу, саліцил, сахарозу, сорбіт, ескулін і при цьому не здатний ферментувати мелібіозу, манозу, арабінозу та ксилозу. Коефіцієнт подібності з L. rhamnosus становив 96,5%.
Штам Lactobacillus reuteri за морфотипом та біохімічними властивостями дуже схожий на Lactobacillus fermentum, але на відміну від останнього не ферментує L-арабінозу. Коефіцієнт подібності з L. reuteri становив 94,5%.
Отже, в процесі визначення якісного складу лактобактерій у препараті «Лактокен Фемін» нами ізольовано та ідентифіковано наступні види ЛАБ: Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri та Lactobacillus fermentum.
Дослідження якісного складу препарату «Лактокен Фемін» шляхом застосування уже вищезгаданих морфологічних, тинкторіальних (мікроскопія), культуральних, фізіологічних (температурний режим росту) та біохімічних (застосування тест-систем) властивостей дозволив нам також ізолювати 1 вид біфідобактерій. Це грампозитивні, аспорогенні, нерухомі палички, трохи вигнутої булавовидної форми. На поверхні агаризованого поживного середовища (Bifidobacterium агар) в мікроаерофільних умовах виявлені мікроорганізми росли у вигляді білих, кремових колоній округлої форми з рівними краями діаметром 1-2 мм.
За біохімічними властивостями ізольовані біфідобактерії були каталазонегативні, не утворювали сірководню (H₂S), не відновлювали нітрати в нітрити, не мали уреазної активності, не розщеплювали желатин, і росли в температурному діапазоні 37 – 41°С.
Bifidobacterium bifidum мав наступні морфологічні і тинкторіальні ознаки: грам-позитивні довгі палички, нерухливі, спор і капсул не утворюють.
Оскільки даний штам мікроорганізму зброджував глюкозу, галактозу, лактозу, сахарозу та не утилізував арабінозу, ксилозу, рибозиу, манозу, фруктозу, мальтозу, рафінозу, сорбіт, інулін, маніт, інозит та трегалозу, він був віднесений до виду B. bifidum. Коефіцієнт подібності ідентифікації з B. bifidum становив 96%.
ЗАКЛЮЧЕННЯ
У складі препарату нами ідентифіковано 6 видів лактобактерій: Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri та Lactobacillus fermentum та 1 вид біфідобактерій (Bifidobacterium bifidum), що повністю відповідає заявленому складу препарату (табл. 1). У складі препарату не виявлено умовно-патогенних бактерій та міскроскопічних грибів.
Для дослідження якості біопрепарату, а саме дієтичної добавки “Лактокен Фемін”, наданої замовником ТОВ “ЕС ФАРМА” у вигляді капсул, с. п. EF2101015, виробництва Біоділ Фармасьютікалс Пвт. Лтд, Індія, нами проведено мікробіологічний аналіз кількісного вмісту всіх ізольованих мікроорганізмів та здійснено їх біохімічну ідентифікацію.
Замовником, надано 2 упаковки препарату. Форма препарату це темно-рожевого кольору капсула, наповнена гранульованим порошком білого кольору з характерним запахом, що відповідає заявленим характеристикам.
У відповідності до заявленого на упаковці складу препарату (лакто- і біфідобактерій), а також враховуючи унікальні культуральні особливості останніх, для їх виділення використовували адекватні селективні поживні середовища, застосовували видоспецифічні температури вирощування, аеробні та анаеробні умови тощо.
Всі дослідження виконували згідно внутрішнього протоколу, затверджено директором із наукового розвитку ТОВ «Едієнс» д. б. н., проф. Бойко Надією Володимирівною.
Вміст біопрепарату “Лактокен Фемін” попередньо розчиняли у бульйоні (MRS Broth) для виділення пробіотичних штамів. Визначення вмісту різних штамів мікроорганізмів у складі препарату проводили кількісним методом. Для цього одержану суспензію титрували (методом серійних розведень) і висівали по 10 мкл кожного розведення (10¹ , 10², 10⁴, 10⁶, 10⁸, 10¹º) в двох повторах на відповідні поживні середовища, зокрема:
1) MRS – агар (середовище із додаванням марганцю, магнію та ацетату для вирощування лактобактерій),
2) Bifidobacterium агар (модифікований агар для вирощування біфідобактерій),
3) удосконалений нами “капустяний” агар (середовище для культивування лакто- та біфідобактерій), авторського складу.
Зразки інкубували в аеробних та мікроаерофільних (факультативно-анаеробних умовах, при 5% СО₂) та при двох температурних режимах (37 °С та 42 °С) протягом 48 годин. Анаеробні умови забезпечували шляхом вирощування тестованих культур в анаеростаті малого об’єму з використанням анаеропакетів (поглиначів кисню). Для перевірки даного препарату на наявність умовно-патогенних мікроорганізмів вміст препарату висівали на селективні поживні середовища: кров’яний агар, м'ясо-пептонний агар, агар для вирощування клострирій, Сабуро агар (для виділення мікроскопічних грибів).
Культуральні властивості ізольованих бактерій визначали за характером їхнього росту на щільних поживних середовищах, визначаючи морфотипи одержаних колоній. Для попередньої орієнтовної ідентифікації всіх ізольованих пробіотичних культур досліджували їх морфологічні та тинкторіальні (мікроскопічні) особливості, здійснюючи наступне оцифрування мазка. Остаточну видову ідентифікацію чистих культур мікроорганізмів проводили шляхом використання біохімічних тест-систем ANAEROTEST виробництва Erba LaChema (Брно, Чеська Республіка). Дана система передбачає облік результатів утилізації (розщеплення) 49 вуглеводів та їх похідних: гліцерину, еритриту, D-арабінози, L-арабінози, D-рибози, D-ксилози, L-ксилози, D-адоніту, метил-β-D-ксилопіранозиду, D-галактози, D-глюкози, D-фруктози, D-манози, L-сорбози, L-рамнози, дульциту, інозиту, D-маніту, D-сорбіту, метил-α-D-манопіранозиду, метил-α-D-глюкопіранозиду, N-ацетилглюкопіранозиду, амігдаліну, арбутину, саліцину, D-целобіози, D-мальтози, D-лактози, D-мелібіози, цукрози, D-трегалози, інуліну, D-мелецитози, D-рафінози, крохмалю, глікогену, ксиліту, гентибіози, D-туранози, D-ліксози, D-тагатози, D-фукози, L-фукози, D-арабітолу, L-арабітолу, глюконату, 2-кетоглюконату, 5-кетоглюконату. Заміри результатів реакцій проводили через 48 годин, кодування здійснювали за відповідними таблицями кодів.
Таким чином, нами було охарактеризовано морфологічні, тинкторіальні, культуральні та фізіолого-біохімічні властивості відібраних ізолятів лакто- та біфідобактерій.
За морфологічними ознаками лактобактерії є грампозитивні палички правильної форми з тенденцією до ланцюгоутворення.
За культуральними властивостями вони належать до морфотипів лактобактерій, при цьому демонструючи штамові відмінності в рисунку і пігментах утворених колоній. Так, зокрема на поверхні авторського модифікованого нами капустяного агаризованого середовища було виявлено шість морфовидів різних за формою колоній лактобактерій. Зокрема, до прикладу, один із видів тестованих штамів лактобактерій (ЛАБ) на поверхні капустяного агару та поживного середовища MRS (МРС) утворював дрібні, округлі, білі або білувато-кремові напівпрозорі колонії з цільними краями, тягучої консистенції. Інший штам ЛАБ на поверхні тих же поживних середовищ утворював інший морфотип колоній - дрібні, круглі, блискучі білувато-кремові колонії з білими краями. Третій штам молочнокислих бактерій ріс у вигляді середніх, білих, круглих, випуклих з рівними краями колоній. Також на поверхні поживного середовища MRS (МРС) вирощено напівпрозорі, білуваті колонії, гладенькі з блиском, слабо випуклі, круглі з нерівним краєм, а також опуклі колонії з цілісним краєм, непрозорі і не пігментовані.
Всі ізольовані нами штами ЛАБ за їх біохімічними властивостями були каталазопозитивні і не здатні до відновлення нітратів, що дозволяє віднести їх до роду Lactobacillus. Ізольований штам лактобацил, що зброджував D-манозу, манітол, сорбітол, α-метил-D-глюкозид, лактозу, сахарозу, малазітозу, інулін, β-гентабіозу, D-туранозу, D-ліксозу, D-тагатозу, L-арабітол, глюконат був ідентифікований як Lactobacillus casei. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. casei складав 98,9%.
Встановлено, що ще один штам серед числа ізольованих нами лактобактерій метаболізував L-арабінозу, D-галактозу, D-глюкозу, D- та L-ксилозу, D-лактозу, D-маніт, D-рафінозу, D-сорбіт, D-фруктозу, D-целобіозу, D-цукрозу та не утилізував L-рамнозу. Саме тому він був ідентифікований нами як Lactobacillus рlantarum. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. рlantarum був 99,7 % за цим методом типування.
До виду Lactobacillus acidophilus було віднесено штам ЛАБ, який утилізував N-ацетил-глюкозамін, галактозу, рафінозу. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. acidophilus становив 98,5 %.
Один штам за здатністю метаболізувати L-арабінозу, рибозу, D-манозу, манітол, ά-метил-D-манозид, лактозу, мелібіозу, сахарозу, D-рафінозу, амідон, глікоген, β-гентабіозу, D-туранозу, D-арабітол, глюконат був ідентифікований як Lactobacillus fermentum. Коефіцієнт подібності ідентифікації з L. fermentum складав 98,5 %.
Штам Lactobacillus rhamnosus зброджував целобілозу, галактозу, мальтозу, маніт, манозу, рафінозу, саліцил, сахарозу, сорбіт, ескулін і при цьому не здатний ферментувати мелібіозу, манозу, арабінозу та ксилозу. Коефіцієнт подібності з L. rhamnosus становив 96,5%.
Штам Lactobacillus reuteri за морфотипом та біохімічними властивостями дуже схожий на Lactobacillus fermentum, але на відміну від останнього не ферментує L-арабінозу. Коефіцієнт подібності з L. reuteri становив 94,5%.
Отже, в процесі визначення якісного складу лактобактерій у препараті «Лактокен Фемін» нами ізольовано та ідентифіковано наступні види ЛАБ: Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri та Lactobacillus fermentum.
Дослідження якісного складу препарату «Лактокен Фемін» шляхом застосування уже вищезгаданих морфологічних, тинкторіальних (мікроскопія), культуральних, фізіологічних (температурний режим росту) та біохімічних (застосування тест-систем) властивостей дозволив нам також ізолювати 1 вид біфідобактерій. Це грампозитивні, аспорогенні, нерухомі палички, трохи вигнутої булавовидної форми. На поверхні агаризованого поживного середовища (Bifidobacterium агар) в мікроаерофільних умовах виявлені мікроорганізми росли у вигляді білих, кремових колоній округлої форми з рівними краями діаметром 1-2 мм.
За біохімічними властивостями ізольовані біфідобактерії були каталазонегативні, не утворювали сірководню (H₂S), не відновлювали нітрати в нітрити, не мали уреазної активності, не розщеплювали желатин, і росли в температурному діапазоні 37 – 41°С.
Bifidobacterium bifidum мав наступні морфологічні і тинкторіальні ознаки: грам-позитивні довгі палички, нерухливі, спор і капсул не утворюють.
Оскільки даний штам мікроорганізму зброджував глюкозу, галактозу, лактозу, сахарозу та не утилізував арабінозу, ксилозу, рибозиу, манозу, фруктозу, мальтозу, рафінозу, сорбіт, інулін, маніт, інозит та трегалозу, він був віднесений до виду B. bifidum. Коефіцієнт подібності ідентифікації з B. bifidum становив 96%.
ЗАКЛЮЧЕННЯ
У складі препарату нами ідентифіковано 6 видів лактобактерій: Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri та Lactobacillus fermentum та 1 вид біфідобактерій (Bifidobacterium bifidum), що повністю відповідає заявленому складу препарату (табл. 1). У складі препарату не виявлено умовно-патогенних бактерій та міскроскопічних грибів.
Порівняння заявленого складу препарату та результатів проведеного тестування
Контроль чистоти препарату «Лактокен Фемін»
